微流控芯片作為微型化液體環境的細胞培養裝置，具有穩定的技術及其功能，近年來在 生物工程、生物醫藥、醫療檢測領域有著很好的延伸前景，每種領域里都有相應的微流控芯片類型，衍生出了較多種類的微流控芯片。同時，每種不同材料的微流控芯片都具有其相應的材料特性，也有不同的檢驗檢測方法。iGEM 是來自麻省理工大學的世界性合成生物學競賽，比賽倡導通過合理的合成生物學改造來解決實際遇到的問題。2017 年是 iGEM_BIT 隊與 XMU-CHINA 合作的第一年，本文主要介紹了兩隊的微流控芯片制作、檢測方法以及實驗成果展示。

在 10~100μm 寬的溝道系統中對流體或氣體進行操控的技術被稱為微流控技術，以微流控技術為核心、通過 MEMS技術加工出的應用于生物、化學、生物醫學等領域的芯片型微全分析系統被稱為微流控芯片。20 世紀 90 年代中后期，隨著微制作技術的發展，微流控芯片研究經歷了一個迅速發展的時期，制作技術也日臻完善，各種基于微流控芯片的單元操作技術也層出不窮。進入到 21 世紀初后期，大規模集成成為微流控芯片的發展潮流。目前微流控芯片已經成為發展最為迅猛的分析研究技術。

目前常見微流控芯片主要有三個種類：單晶硅片、石英和玻璃、高分子聚合物。

最早的微流控芯片是用單晶硅制作。這主要得益于成熟的微電子和微機械加工技術。玻 璃微流控芯片具備優良的光學性能和支持電滲流特性，易于表面改性，可直接借鑒傳統的毛 細管電泳分析技術，因此在微流控芯片發展初期受到更多重視并得到相應發展，至今仍是最 廣泛使用的芯片之一。用玻璃材料制作微流控芯片具有很多的優越性，但聚合物以其較玻璃 價廉，制作方法簡單，生產成本低，可制作一次性使用芯片等特點，正日益為人們所關注。

為了實現 2017iGEM_BIT 隊伍生物部分的工業大規?；a，iGEM_BIT 隊伍自主設計研 發了微流控芯片。 微流控芯片為整套生物學檢測方法提供了兩個反應腔室，兩個腔室分別是用于磁珠適配體的檢測和工程菌的熒光表達。通過真空凍干法將適配體和工程菌菌液預先分步凍干于芯片內，將使得芯片的快速檢測程度得到很大的提升。此外，設計的儀器采用了 同時能檢測紅光和綠光的共聚焦式光學通路（光學器件來自于公司名），有效的降低了光學 儀器占用的空間，又不影響光學檢測精度。儀器中配套微流控芯片負壓法注樣而使用的蠕動泵，最低泵速為 6ul/min，在 39ul/min 時達到最好精度 （±2%）。

在項目研發過程中，我們設置并進行了以下的實驗：

1、 微流控芯片及芯片外工程菌的生長曲線測定

2、 微流控芯片及芯片外含阿拉伯糖誘導型啟動子的工程菌在阿拉伯糖誘導下報告基因的 表達情況（芯片外測試涉及到無氧情況的影響）

3、 微流控芯片內磁珠適配體凍干實驗（包括芯片外凍干及與甲胎蛋白反應情況）

4、 微流控芯片的光學檢測（定性）

5、 微流控芯片的熱學檢測（定量）

6、 光學儀器的模擬

實驗展示：

一、 微流控芯片及芯片外工程菌的生長曲線測定

實驗目的：表征細菌在芯片上的生長情況，評估芯片的細菌培養能力

設計思路：通過 OD 值與熒光強度來表征細菌的生長狀況并通過與芯片外（培養試管內）細 菌生長情況對比反映芯片的細菌培養能力。用于測定這兩個參數的酶標儀不支持對芯片的直 接檢測，因此需設法將芯片內菌液排出?？紤]到芯片內菌液的體積定量問題與余液問題，我 們采用了排出液體——定量取液——稀釋的方法從芯片內取出菌液置于 96 孔板上進行檢測。

實驗設計：變量設計：時間（每 2 小時測定一次）

對照設計：細菌生長場所：芯片內與培養試管內

結果指標：由測量結果繪制的 OD-時間曲線與熒光強度-時間曲線

實驗材料：7ml LB 無抗培養基、無菌水、氯酶抗生素（與菌種抗性有關）、負二十攝氏度 甘油保藏的菌種、注射器、微流控芯片（使用直徑 12mm 圓形培養腔，腔室高度 0.4mm， 準備數量由預計測量時間與測量間隔決定）、96 孔板、1.5ml 離心管（每次檢測 2 個）

實驗步驟：

①：芯片預處理

使用注射器以 100μl/min 的流速分別注入 5ml 無水乙醇和 3ml PBS 緩沖液，隔夜晾干。

注意：

①：芯片的預處理對于芯片培養細菌的能力有很大影響

②：乙醇可沖洗掉未完全固化的光膠

③：PBS 的作用在于沖洗掉殘留乙醇并對芯片腔室表面進行處理，利于細菌生存

②：隔夜復蘇菌種 J-D-P(plux-RBS-LuxR-RBS-Luxl-RBS-LacI-RBS-GFP-T)（可表達 GFP） 7ml 無抗培養基加入 3‰的氯酶（21μl）和 100μl 負二十攝氏度甘油保藏的菌種，在 37℃ 搖床隔夜培養。

③：轉接菌種

7ml 無抗培養基加入 3‰的氯酶（21μl）和 100μl 隔夜培養的菌液，在 37℃搖床培養 1h。

④：開始檢測，注入菌液

在培養試管中均勻取 100μl 菌液點樣在 96 孔板上，點三次樣，檢測 OD 值和熒光強度。 在培養試管中均勻取 100μl 菌液加入潔凈 1.5ml 離心管中，用注射器吸取菌液注入芯片， 將芯片置于槍頭盒內，放入 37℃搖床培養。

注意：由于實驗過程中未使用泵進行注射，因此此注射方式為手動注射，要求用力盡量均勻 并稍微傾斜芯片防止注射過程中產生氣泡

⑤：排出菌液檢測

兩個小時后，取出芯片，用注射器注入空氣，排出菌液至 1.5ml 潔凈離心管。從離心管與 培養試管中分別吸取 70μl 的菌液至另外一潔凈 1.5ml 離心管，另吸取 280μl 無菌水稀 釋菌液。再從稀釋的菌液中取 100μl 點樣于 96 孔板上，各點三次樣，檢測 OD 值和熒光 強度。

注意：可傾斜芯片使液體順利排出

⑥：重復⑤每兩個小時測一次。

⑦：畫出 OD-時間曲線和熒光強度-時間曲線。

實驗結果：

圖 1 12 小時培養得到的大腸桿菌的 OD-時間曲線和熒光強度-時間曲線

結果分析：

由曲線可以看出，芯片內 OD 曲線在 8h 后有比較明顯的下滑，芯片內的熒光強度在 4-12h 也呈下降趨勢，且芯片內的 OD 值整體低于離心管內 OD 值。我們分析可能的原因在于：①： 芯片內環境相對試管中較為狹窄，對細菌的代謝活動有一定影響。②：芯片透氣性不足，菌 群數量達到一定程度時面臨缺氧問題。

二、微流控芯片及芯片外含阿拉伯糖誘導型啟動子的工程菌在阿拉伯 糖誘導下報告基因的表達情況（芯片外測試涉及到無氧情況的影響）

模塊一：探究芯片內缺氧環境對細菌生長表達的影響

實驗設計：由于之前在芯片中的細菌的培養實驗結果與離心管內培養的結果相差較大，經過 分析我們認為可能芯片內的缺氧環境對細菌的生長和表達產生了影響。所以我們設計了芯片 外的模擬缺氧環境來探究這種影響。并且使用了受阿拉伯糖誘導表達的大腸桿菌作為菌株， 設置不同濃度的阿拉伯糖濃度（10g/L、5g/L、1g/L、0.1g/L、0.01g/L、0g/L）。

實驗材料：受阿拉伯糖誘導表達的大腸桿菌（pbad-RBS-LacI-RBS-GFP-T-plac-RBS-RFP-T）、 氨芐抗生素（AMP）、100mg/ml 的阿拉伯糖溶液、7ml 無抗 LB 液體培養基、無菌水、PCR 管、 1.5ml 離心管、96 孔板。

實驗步驟：

①加入材料，復蘇細菌

在 7ml 無抗 LB 培養基中分別加入 100μl 甘油保存的菌種、1‰的 AMP（7μl）， 再分別加入 0.7μl、7μl、70μl、350μl、700μl 的 100mg/ml 的阿拉伯糖溶 液。置于 37℃搖床培養復蘇 1h。

②分裝入 PCR 管和離心管

取出復蘇的菌，分別加入 100μl 吹勻菌液至 1.5ml 離心管（每一個梯度阿拉伯 糖各四管），250μl 吹勻菌液至 PCR 管（基本加滿，每一個梯度阿拉伯糖各四管）。 在放置板上放置好，置于 37℃搖床培養。另取 100μl 菌液在 96 孔板點樣，每 一個梯度點三次，檢測 OD 和熒光。

③稀釋檢測

每兩個小時取出每個濃度的 PCR 管和離心管，各取出 70μl 置于另一潔凈 1.5ml 離心管，稀釋 5 倍，取 100μl 菌液在 96 孔板點樣，各點三次，檢測 OD 和熒光。

④拷出數據，畫出生長表達曲線。

實驗結果：

圖 2 本次的阿拉伯糖的誘導試驗:離心管和 PCR 管內大腸桿菌的生長曲線和熒光曲線 圖 3 以前的阿拉伯糖的誘導實驗：96 孔板內大腸桿菌的熒光曲線

實驗結果表明缺氧環境下細菌的生長和表達都用一定的下降，這的確是在芯片內培養菌 和在外界培養的一個較大不同，關于阿拉伯糖濃度對大腸桿菌誘導，對比之前所作實驗（探 究阿拉伯糖對工程菌的熒光表達的影響）可以發現阿拉伯糖的誘導并非濃度越高越有效。

一、 微流控芯片內磁珠適配體凍干實驗（包括芯片外凍干及與甲胎蛋 白反應情況）

微流控芯片的光學檢測（定性）

實驗目的：查看芯片的光學分布

實驗設備：3 個芯片中的 6 個腔室、一支 1mL 注射器、4 個離心管。

實驗材料：熒光微球蛋白溶液、熒光素鈉溶液

實驗步驟：實驗分為兩個部分：一、定性部分 二、定量部分

定性部分

1、先將熒光相比熒光素鈉較強的熒光微球蛋白 50uL 溶液注入芯片。

2、芯片在注射過程中保持傾斜 30°角，實驗人在注入過程中盡量保持注射過程 緩慢而勻速。

3、為了做比對，選擇將濃度不變的熒光微球直接滴加到載玻片上，觀察熒光分 布。

4、在原載玻片上蓋上蓋玻片，再觀察熒光分布。

定量分布

1、稱取 0.3763g 的熒光素鈉加入到 10mL 的蒸餾水中，配成 0.1mol/L 的熒光素 鈉溶液。

2、將 0.1mol/L 的熒光素鈉溶液分別稀釋 7000 倍、10000 倍、20000 倍分別得到 熒光素鈉溶液①、②、③。

3、各抽取熒光素鈉溶液①、②、③100uL 加入到 96 孔板中進行熒光值的測量（增 益選 50）。 3、將熒光素鈉溶液①、②、③分別加入到芯片中，觀察熒光分布。

實驗結果：

表 3 熒光素鈉溶液的熒光值

實驗結論：

一、首先比較了圖一、圖二我們發現我們的芯片透光性很好，在芯片內和在載玻片上的熒光 是差不多的。

二、通過圖 3，即蓋上了蓋玻片以后，我們發現熒光強度大大減小，本來為了做對比，應該 找一個能裝 50uL 的槽蓋上載玻片進行觀察?？墒怯捎跅l件較為嚴苛，未能實驗，但是我們 結合第一個結論，依然可以得出光膠并未太多的影響光的分布

三、通過圖 4、圖 5、圖 6，我們可以發現芯片的透光性還是可以的。結合圖 7 我們的熒光 測量，則定量的說明了我們芯片的透光性良好

四、微流控芯片的熱學檢測（定性/量）

光學儀器的模擬

實驗目的：驗證我們設計的檢測光路，根據驗證結果優化光路

設計思路：使用實際元件進行光路驗證存在諸多不便：首先光學元件價格較高，盲目進行實 驗可能造成不必要損失，其次，根據驗證結果不斷調整元件位置的過程較為費時費力。為了 避免時間與金錢的浪費，我們采用光學仿真的方法來為我們后續的光路搭建提供指導與參考。

實驗設計：利用 Zemax 軟件，根據 thorlabs 網站上提供的元件參數進行模擬光路搭建過程， 并通過在軟件中查看檢測面的光圈分布評判我們光路的效果，并以此為根據對我們的光路進 行改良。

使用元件：平凸透鏡（2 個）型號：LA1304，焦距：4mm，曲率半徑：20.6mm 二向色鏡（實際仿真過程中表現為反射面）

實驗過程：

圖 13 光學仿真使用的 ZEMAX 界面

圖 14 光學仿真中的光路圖

仿真過程主要出現了兩個問題：

1、光圈過小

解決方法：光圈過小，最先想到的是兩個方面：一、透鏡折射率過大，二、檢測面與二色鏡 靠的太近，所以最直接的是將檢測面的 Y 值（即縱坐標值）由 30 變為 40. 此時出現了第二個問題

2、光圈太暗

解決方法：從上圖中我們發現光的發散角過大，導致很多光都照到了管壁，所以減小發散角 或增加光闌即可，于是得到最終結果。

圖 15 光學仿真中遇到的問題

圖 16 偵測器結果

從圖 2 我們可以得知光路仿真結果較好，光的分布較為均勻，光的強度較弱，是因為光源選 的功率只有 1W，簡單地增加光源強度即可，此處不再贅述。

結論：

我們選用的 LA1304 透鏡符合我們的基本要求，達到我們較為理想的結果，仿真成功。