單細(xì)胞測(cè)序已逐漸成為科研熱點(diǎn)，它解決了用組織樣本測(cè)序或樣本少時(shí)無(wú)法解決的細(xì)胞異質(zhì)性難題，為科學(xué)家研究解析單個(gè)細(xì)胞的行為、機(jī)制、與機(jī)體的關(guān)系等提供了新方向。但是單細(xì)胞測(cè)序遇到的第一個(gè)難題就是：“如何獲取單細(xì)胞？”

1.有限稀釋法（Limiting Dilution）

有限稀釋法是根據(jù)細(xì)胞懸液濃度的計(jì)算，逐步稀釋得到一定體積內(nèi)只有1個(gè)或少量細(xì)胞的方法（一般為1 ul，多數(shù)WGA/WTA試劑盒可容納投入體積）。

該方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊設(shè)備。但是，由于分選基于濃度計(jì)算，無(wú)法直接觀察，容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。

2.顯微操作法（Micromanipulator）

顯微操作法是將細(xì)胞懸液置于顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞挑選的方法，細(xì)胞挑選過(guò)程更直觀。低配版顯微操作，可以使用口吸管（英文名：Aspirator tube assembly）來(lái)進(jìn)行；如果有經(jīng)濟(jì)實(shí)力的客戶(hù)，可以使用顯微操作臺(tái)進(jìn)行操作。首先，需要將細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑵舛仍?0個(gè)細(xì)胞每微升為宜。吸取細(xì)胞時(shí)，毛細(xì)管內(nèi)不能有太多的緩沖液，保證毛細(xì)管內(nèi)液體在1ul左右。然后將毛細(xì)管內(nèi)液體吹入反應(yīng)管中，反應(yīng)管中預(yù)先加入的4 ul裂解液，這一過(guò)程切忌產(chǎn)生氣泡。

顯微操作的優(yōu)勢(shì)在于能夠準(zhǔn)確地控制單細(xì)胞的吸取與釋放；其缺點(diǎn)在于通量低，對(duì)操作人員的技術(shù)要求高。

3.熒光流式分選（FACS）

熒光流式分選能夠很好的實(shí)現(xiàn)大量細(xì)胞的分選過(guò)程，并且能夠做到精度高、通量大。但是它要求的細(xì)胞數(shù)量多，需要的樣本初始體積較大，使一些小體積或微量樣本 ( 如細(xì)針穿刺液 ) 分離單細(xì)胞受到了制約。該方法需要配備具有分選功能的流式細(xì)胞儀。在進(jìn)行流式分選的過(guò)程中，需要先將樣本制成細(xì)胞懸液。不同形式的樣品，制作細(xì)胞懸液的方法也有所不同。

我們最為常見(jiàn)的樣本類(lèi)型有：新鮮實(shí)體組織、外周血單核細(xì)胞（PBMC）及培養(yǎng)細(xì)胞等。其中，新鮮實(shí)體組織需要經(jīng)過(guò)酶解法、機(jī)械法或者化學(xué)處理法等方法進(jìn)行細(xì)胞分散，制作細(xì)胞懸液。在制作細(xì)胞懸液的過(guò)程中需要注意：①無(wú)菌操作；②操作過(guò)程要迅速；③染色和固定避免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害；④在分選前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性統(tǒng)計(jì)。

4.微流控技術(shù)（Microfluidics）

微流控技術(shù)可利用重力離心、流體力學(xué)、電場(chǎng)力等來(lái)捕獲細(xì)胞，也可以通過(guò)流體力學(xué)利用細(xì)胞大小、細(xì)胞表面標(biāo)志物等進(jìn)行分選，同時(shí)可以整合細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞捕獲分選、細(xì)胞裂解及后續(xù)的檢測(cè)分析基于一體。可直觀辨別目的細(xì)胞、實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞分離、自動(dòng)化集成化。

5.激光顯微切割技術(shù)（LCM）

對(duì)于切片組織樣本，我們需要用到激光顯微切割技術(shù)。該方法可直接觀察分離樣本，避免分離偏差；可以通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察，分離稀有細(xì)胞；同時(shí)可以了解到細(xì)胞的位置信息。但是，該方法也存在著分離通量低的缺陷，而且分離的過(guò)程中可能會(huì)破壞細(xì)胞的完整性。

在進(jìn)行該方法的細(xì)胞分離時(shí)需要注意：①需要選擇合適的細(xì)胞染料，避免染色過(guò)程中的RNA降解；②切片制作及細(xì)胞切割操作要盡量迅速；③分選下來(lái)的細(xì)胞附著在膜片上，可先將膜片上的核酸收集于大體積體系后再濃縮。

總之，細(xì)胞分選的方法多種多樣。我們需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的特點(diǎn)、樣本的細(xì)胞數(shù)量以及實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路等因素綜合考慮，選擇最合適的單細(xì)胞分選方法。