在生物檢測(cè)應(yīng)用中，拉曼光譜SERS(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)逐漸發(fā)展成為一種最常用的多功能方法之一。與其他傳統(tǒng)的生物檢測(cè)手段相比，SERS檢測(cè)突出的優(yōu)點(diǎn)包括極窄的峰寬、高靈敏度多元檢測(cè)能力和較寬的動(dòng)態(tài)范圍等。構(gòu)建功能化的SERS探針是SERS生物應(yīng)用中的一個(gè)重要前提。一般而言，在SERS基底上修飾拉曼分子和特定的生物靶向分子就可以獲得面向生物傳感應(yīng)用的SERS光學(xué)探針。圍繞SERS探針進(jìn)行的生物傳感與檢測(cè)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。

設(shè)計(jì)該類(lèi)探針時(shí)要考慮到以下幾個(gè)方面：SERS活性，靶向效率, 納米結(jié)構(gòu)及光學(xué)特性的穩(wěn)定性及多元檢測(cè)能力等。為實(shí)現(xiàn)特定的生物探測(cè)功能，通常會(huì)在SERS探針的表面修飾特定的生物靶標(biāo)分子，如抗體、DNA等。已有報(bào)道中，典型的SERS探針結(jié)構(gòu)如圖 5所示。Feng Jingjing等人將金納米粒子通過(guò)DNA適體連接在金納米棒兩端制成探針，利用在金納米粒子與金納米棒之間非常狹窄的縫隙極強(qiáng)的電磁增強(qiáng)得到顯著的初始SERS信號(hào)(圖 5(a))。連接二者的適體同時(shí)可以作為識(shí)別分子與待測(cè)物BPA反應(yīng)而使金納米粒子從納米棒上脫離，導(dǎo)致SERS信號(hào)的減弱。故這里的SERS信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)物的濃度成反比關(guān)系。

類(lèi)似的結(jié)構(gòu)還有在金納米星外通過(guò)適體DNA連接銀納米粒子而形成衛(wèi)星型復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中DNA適體的優(yōu)點(diǎn)之一是提高了對(duì)待測(cè)物的靶向性。Shi Huayi等人設(shè)計(jì)了一種基于適體的探針(圖 5(b))，可以特異性的識(shí)別待測(cè)物ATP并形成環(huán)狀的復(fù)合物，從而使一開(kāi)始與其雜交的兩條單鏈DNA分離，最終導(dǎo)致修飾的兩個(gè)拉曼分子的SERS信號(hào)產(chǎn)生差異而形成SERS比率計(jì)型探針。由于靶標(biāo)分子要識(shí)別待測(cè)物而使探針整體暴露在環(huán)境中，增加了環(huán)境中的分子對(duì)探針信號(hào)影響的風(fēng)險(xiǎn)。Jiang Tao等人在銀納米粒子外包裹一層介孔硅，再在硅殼上吸附一層銀納米粒子形成三層的復(fù)合結(jié)構(gòu)，在保證SERS信號(hào)強(qiáng)度的前提下提升了探針的穩(wěn)定性(圖 5(c))。

圖 5 (a) 基于金納米粒子-金納米棒復(fù)合體檢測(cè)BPA的SERS適體探針示意圖；(b)檢測(cè)ATP的SERS比率計(jì)硅片適體探針示意圖；(c)銀@介孔硅@銀三層核殼結(jié)構(gòu)納米粒子制備流程示意圖；(d)合成19種SERS編碼納米粒子的編碼、結(jié)構(gòu)及光譜

在合成出功能化的SERS探針之后，即可利用它們進(jìn)行目標(biāo)物的檢測(cè)。常見(jiàn)的待測(cè)物包括DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、藥物、離子等。DNA作為一種生物標(biāo)記物在一些疾病診療上扮演著重要的角色，而Fu Xiuli等人就選取了HIV-1 DNA作為目標(biāo)物并設(shè)計(jì)了側(cè)向流(LF)條帶實(shí)驗(yàn)來(lái)定量檢測(cè)分析(圖 6(a))。側(cè)向流條帶被認(rèn)為是一種出色的現(xiàn)場(chǎng)護(hù)理診斷工具，其與SERS的聯(lián)用可以解決低濃度檢測(cè)等問(wèn)題，也證明了SERS可以與很多平臺(tái)兼容互補(bǔ)。在腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)中，蛋白質(zhì)尤其是抗原的檢測(cè)占據(jù)了很大的比例。

Liguang等人利用DNA適體將銀納米粒子組裝成金字塔結(jié)構(gòu)作為SERS探針，可以檢測(cè)前列腺抗原(PSA)、凝血酶和粘蛋白三種目標(biāo)分子(圖 6(b))。除了小分子的生物標(biāo)志物，細(xì)胞也是SERS進(jìn)行生物檢測(cè)的目標(biāo)之一。Nagappanpillai等人將熒光染料BODIPY當(dāng)作拉曼分子制成SERS探針并用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞(圖 6(c))，這種納米探針的識(shí)別效率非常高并且可以進(jìn)行細(xì)胞成像。我們研究組在SERS的生化檢測(cè)方面也做了大量的研究工作，例如端粒酶活性檢測(cè)、蛋白質(zhì)免疫檢測(cè)、汞離子檢測(cè)、農(nóng)藥檢測(cè)等。其中，端粒酶的長(zhǎng)度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中用著絲粒的SERS強(qiáng)度作為內(nèi)標(biāo)排除其他因素對(duì)SERS信號(hào)的影響，用端粒酶與著絲粒探針強(qiáng)度的比來(lái)確定端粒酶長(zhǎng)度(圖 6(d))。這種SERS原位雜交(in situ hybridization)的靈敏度非常高，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)端粒酶的檢測(cè)。

圖 6 (a) A：實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)示意圖。B：基于SERS的側(cè)向流條帶實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)HIV-1 DNA的檢測(cè)原理。(C為對(duì)照組，T為實(shí)驗(yàn)組)；(b)銀納米金字塔由DNA框架自組裝SERS分析生物標(biāo)志物示意圖。C：通過(guò)外泌體、磁球和SERS探針間免疫識(shí)別形成的三明治結(jié)構(gòu)；(c)利用BODIPY修飾的納米粒子SERS成像示意圖；(d)SERS探針與基因組DNA的雜交原理示意圖

此外，利用SERS光譜十分窄的特點(diǎn)，人們提出了基于SERS的光譜編碼技術(shù)，生成的光譜碼可以用于多元待測(cè)物的同時(shí)檢測(cè)。我們提出了一種波長(zhǎng)-光強(qiáng)雙編碼的SERS探針(圖 5(d))。利用3種拉曼分子的光譜以及強(qiáng)度兩類(lèi)不同信息的組合，可得到多達(dá)19種不同的SERS光譜。Lai Yuming等人選了5種拉曼分子進(jìn)行編碼制成SERS探針并用PS微球裝載(圖 7(a))，獲得了31種不同光譜編碼的PS球。值得注意的是，將SERS光譜與其他光學(xué)手段結(jié)合可以顯著提高可編碼容量。例如，我們提出了一種SERS-熒光共編碼的光學(xué)編碼新方法(SFJSE)，并利用有機(jī)-金屬-量子點(diǎn)復(fù)合納米結(jié)構(gòu)構(gòu)筑了一類(lèi)SFJSE光學(xué)編碼微球作為探針(圖 7(b))。這種SFJSE編碼方案借助熒光-SERS聯(lián)合光譜拓展了可編碼光譜的有效范圍，與傳統(tǒng)單一熒光信號(hào)編碼方法相比，可編碼數(shù)量獲得了指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。此外，通過(guò)不同種編碼分子錯(cuò)層分布的策略簡(jiǎn)化了編碼微球的設(shè)計(jì)方案，并大大減輕了信號(hào)串?dāng)_、制備復(fù)雜等問(wèn)題，對(duì)于獲得大編碼容量的微球具有積極意義。

圖 7 (a) A：硅殼金納米粒子探針的SERS光譜(左)及拉曼分子的分子結(jié)構(gòu)(右)。B：使用不同拉曼分子的SERS標(biāo)簽典型的拉曼光譜(左)及相應(yīng)的編碼(右)。(b)合成的15種納米粒子的構(gòu)成、光譜和編碼

除了高通量檢測(cè)本領(lǐng)之外，基底對(duì)拉曼散射信號(hào)的增強(qiáng)作用使得SERS具有與熒光相當(dāng)?shù)臋z測(cè)靈敏度。因此，SERS技術(shù)在生物傳感的應(yīng)用中展現(xiàn)出了優(yōu)異的檢測(cè)性能。另一方面，SERS檢測(cè)技術(shù)也有局限性。比如，SERS檢測(cè)的步驟相對(duì)繁瑣以及可重復(fù)性相對(duì)較低等。因此，開(kāi)發(fā)高效、可重復(fù)、自動(dòng)化的SERS檢測(cè)技術(shù)成為推廣SERS實(shí)際應(yīng)用時(shí)亟待解決的問(wèn)題之一。近年來(lái)迅速發(fā)展的微流控芯片技術(shù)為人們提供了一種很好的解決方案。

文獻(xiàn)來(lái)源中國(guó)光學(xué)DOI: 10.3788/CO.20181103.0513

作者：王志樂(lè), 王著元, 宗慎飛, 崔一平

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